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微生物监测在生物安全实验室中的一种应用

发布时间:2020-03-19浏览次数:

17年前,SARS冠状病毒引起的“非典”事件,回想起来,仍让人心有余悸。17年后,武汉又爆发了轰动全球的新型冠状病毒肺炎感染事件。112日,世界卫生组织(WHO)正式将造成武汉肺炎疫情的新型冠状病毒命名为2019-nCov

28日下午,国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制成员现决定,将新型冠状病毒感染的肺炎暂命名为“新型冠状病毒肺炎”,英文名为“Novel coronavirus pneumonia”,简称“新冠肺炎”,英文简称NCP

211日晚,国际病毒分类委员会的冠状病毒研究小组(CSG)在医学类预印本发布平台 medRxiv 发表最新关于新型冠状病毒命名的论文,宣布新型冠病毒“2019-CoV”的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2severe acute respiratory syndrome coronavirus 2SARS-CoV-2)。另外,在该篇论文发布前两个小时,世界卫生组织(WHO)也将由新型冠状病毒所致的疾病,正式命名为“COVID-19”。


时值春节假期期间,武汉新型冠状病毒肺炎感染事件为中国最重要的节日蒙上了一层阴影;而亿万人东西南北流动的春运,又令肺炎感染事件雪上加霜,也给全国的交通、医院和疾控系统等带来了巨大的挑战。

中国疾病预防控制中心表示,本次发现的新型冠状病毒与SARSMERS冠状病毒虽同属于冠状病毒这一大家族,但基因进化分析显示它们分属于不同的亚群分支,它不是SARS,也不是MERS病毒,它们的病毒基因序列差异比较大。冠状病毒在自然界中非常常见,分为很多类型,所造成的危害差别也很大,引起武汉病毒性肺炎疫情的病原体为一种新的冠状病毒,有别于SARS病毒。

中国疾病预防控制中心和各省市疾病预防控制中心(简称疾控中心)承担着全国和各个省市的疾病预防与控制、应急预警与处置、疫情收集与报告、监测检验与评价、健康教育与促进、应用研究与指导、业务培训与保障、技术管理与服务等政府对社会的疾病控制职能。

疾控中心的建设要符合我国现行的生物安全实验室各项标准,目前国际上依据实验室所处理对象的生物危险程度,把生物安全实验室分为四级:一级对生物安全隔离的要求最低,四级最高。我国目前有两个四级生物安全实验室:湖北武汉BSL-4病毒实验室(中国科学院武汉国家生物安全实验室 )和国家动物疫病防控高级别生物安全实验室(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)。

科研人员在BSL-3实验室工作

而三级生物安全实验室,即BSL-3实验室,是国家及几乎所有省和直辖市疾控系统中最高等级的生物安全实验室,在疾病预防与控制、应急预警与处置、监测检验与评价等工作中发挥着巨大的作用。BSL-3实验室相对于BSL-1实验室和BSL-2实验室,主要是进行特殊的诊断和研究,脉动真空灭菌柜和过氧化氢空间灭菌器等都是必不可少的安全设施。

德国MMM脉动真空灭菌柜 德国PEA气化过氧化氢空间灭菌器

本次新型冠状病毒需要在BSL-3实验室及以上实验室才能进行实验,所以有极高的无菌要求。传递进出的物品都要灭菌,常见待灭菌物质有:固体(如金属器械、实验室设备、实验室玻璃器具等),多孔物质(如衣物、试管等),开口的液体容器(如实验室内装满水溶液的三角瓶等),生物废弃物(如带菌的培养基、动物尸体)等。

而如何保证脉动真空灭菌柜灭菌效果是至关重要的,因为BSL-3实验室实验操作过程所产生的固体或少量液体废弃物中含有病毒和细菌等有害物质,若病毒等有害物质未完全灭活被排出实验室,其对周边环境有很大污染风险,甚至会将致命病毒传播出去,因此必须要对BSL-3实验室脉动真空灭菌柜灭菌效果进行验证,把污染风险降到最低程度。

BSL-3实验室脉动真空灭菌柜灭菌效果监测方法主要包括以下几类:

一、物理参数监测

在脉动真空灭菌柜的HMI界面上直接监视腔体和夹套温度、压力、灭菌时间等参数,并使用打印机打印、记录下来。另外,脉动真空灭菌柜在整个工作流程过程中,若有温度或压力未满足参数设定值要求,则系统会发出报警,要求运维人员对相应影响因素进行改进。

脉动真空灭菌柜每次运行均须对物理参数进行监测,如灭菌阶段温度、压力和灭菌时间等。若灭菌程序运行过程中有报警发生,必须消除故障后再次运行该程序,直到程序完全运行且无报警发生方可开门取出废弃物。

二、化学监测

化学监测是利用化学指示剂(CI= Chemical Indicator)在一定温度、作用时间与饱和真空适当结合的条件下受热变色的特点,用于间接指示灭菌效果或灭菌过程的监测方法。化学监测常用的方法有:

1)BD测试:用于检查灭菌器腔体经抽真空后残留冷空气的浓度,监测真空水平、是否漏气等,残余冷空气的存在是灭菌器灭菌失败的主要原因。测试时将标准BD测试包放于灭菌器排气口上方,灭菌器内不能放入其它待灭菌物品。循环完成后,取出BD包验证是否满足要求。BSL-3实验室每日开始灭菌运行前进行,合格后方可使用。

2)指示胶带:放在灭菌包外,BSL-3实验室每个灭菌包包外均应贴有包外化学指示胶带或包外指示卡,用于指示每一包物品是否经过了灭菌处理。

3)指示卡:可以指示灭菌温度和持续作用时间,以间接指示灭菌效果。监测时应放于测试包或待灭菌包内。每次灭菌都要使用,每包必用。灭菌后指示色块达到标准颜色为合格,若发现包内指示卡不合格,应找出原因,重新灭菌处理直到合格为止。

三、生物监测:生物监测是一种利用生物指示剂(BI= Biological Indicator)对脉动真空灭菌器灭菌效果进行验证的重要监测方法。将纯棉手术斤折叠成23cm x 23cm x 15cm大小的标准试验包,将两支嗜热脂肪地芽孢杆菌(ATCC7953)放于包中心,将试验包置于灭菌器腔体冷凝水排放口上方,门关闭并密封后从程序列表中选择固体灭菌程序,灭菌周期完成后从包中取出,挤碎指示管内安瓿让培养液浸透管内菌片,放于56℃专用恒温培养箱内培养48h,连同阳性对照管观察结果。所有包内灭菌后指示管内培养液均没有变色,同时阳性对照管内培养液变成黄色,可判定灭菌合格。脉动真空灭菌器每周应进行一次生物监测。

BSL-3实验室过氧化氢空间灭菌器灭菌效果监测方法:

不同于脉动真空灭菌器是对实验操作过程所产生的固体或液体废弃物进行灭菌,气化过氧化氢空间灭菌系统是对BSL-3实验室物体表面及空间进行消毒或灭菌,能有效降低生物安全实验室的生物负载,也能保证生物安全实验室的无菌操作环境。

不同的BSL-3实验室,需要设计不同的过氧化氢空间灭菌方案。过氧化氢空间灭菌器灭菌效果的验证时通过在难以灭菌的位置处放置BI生物指示剂、CI化学指示剂,如天花板、地板等难以到达的角落。CI化学指示剂变色均匀,BI生物指示剂不锈钢片上分布有嗜热脂肪地芽孢杆菌(ATCC12980),灭菌后在55-60℃专用恒温培养箱中进行培养以检测灭菌效果,BI是判断灭菌成功与否的唯一标准。

使用生物监测进行灭菌效果的验证时,BI生物指示剂,即嗜热脂肪地芽孢杆菌的培养对恒温培养箱具有较高的要求:

1. 其中非常重要的是温度的均一性(TemperatureUniformity/In Space):例如在做56℃嗜热脂肪地芽孢杆菌培养时,要求温度均一性为±1℃,即在任一时刻和搁板上任一位置处,温度均在55~57℃范围之内,超出0.1℃即视为偏差和不合格。

2. 升降温时间:微生物实验室恒温培养箱/生化培养箱的使用是非常频繁的,有时候一段时间内开关门的次数会较多,使腔体内温度较快的出现偏差。如何保证恒温培养箱在关门之后进行快速的温度恢复,是衡量其性能的重要因素,故疾控系统、以及出入境检疫检验部门和制药领域的微生物实验室更倾向于采用不锈钢电阻加热管和压缩机制冷的恒温培养箱。

3. 培养效果:有些恒温培养箱经过几天运行之后,会出现培养皿中培养液干燥凝固的情况,造成菌体培养失败或失效。恒温培养箱采用顶部回风和侧面送风的循环方式是避免这种情况的一种比较合理的设计。

德国MMM恒温培养箱

恒温培养箱/生化培养箱不仅可以培养BI生物指示剂,用于脉动真空灭菌器和过氧化氢空间灭菌器灭菌效果的监测,保证生物安全实验室的安全,还可以用于一次性使用卫生用品如手套、口罩和防护服等的微生物检测和卫生保证。

GB19082-2009GB15979-2002中规定了产品微生物检测方法,其中大肠杆菌检测方法:取样液5mL,接种50mL乳糖胆盐发酵管,置35℃±2℃培养24h,如不产酸也不产气,则报告为大肠杆菌群阴性。如产酸产气,则划线接种伊红美蓝琼脂平板,置35℃±2℃培养18-24h,观察平板上菌落形态。典型的大肠杆菌落为黑紫色或红紫色,圆形,边缘整齐,表面光滑湿润,常具有金属光泽,也有的呈紫黑色,不带或略带金属光泽,或粉红色,中心较深的菌落。取疑似菌落1-2个作革兰氏染色镜检,同时接种乳糖发酵管,置35℃±2℃培养24h,观察产气情况。

除了以上生物安全实验室的应用,恒温培养箱/生化培养箱在制药领域无菌控制方面也发挥着必不可少的作用,如《中国药典》2015版四部和2020版四部生物检定通则增修订(公示中)中都明确了其应用和微生物培养的方法。

2020版四部生物检定通则增加了灭菌用生物指示剂指导原则,用于脉动真空灭菌器和过氧化氢空间灭菌器灭菌效果的生物监测。2015版四部中如1101无菌检查法,用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、辅料、原料及其他品种是否无菌的一种方法,防止微生物污染。恒温培养箱/生化培养箱主要应用包含:培养皿、培养瓶是否合格的检测;空气、纯化水、设备表面等以及原料、样品、半成品的检测,防止微生物污染,保证无菌操作和生产,此时培养的真菌或细菌所需的温度为20~25℃,30~35℃,35~37℃和42~43℃等,要求的温度均一性仍为±1℃。

一般疾控系统微生物实验室和出入境检疫检验部门使用几台小的恒温培养箱/生化培养箱(Reach-In)进行BI生物指示剂或细菌、真菌的培养即可满足要求。而对于一些制药企业来说,无论从实验室空间占用方面,还是培养箱内部容积和价格成本方面来说,多台小的恒温培养箱/生化培养箱并不是最优的解决方案,步入式培养箱(Walk-In)反而是更好的选择。


Aralab步入式培养箱

(通过步入式培养箱门上观察窗进行观察)

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